2018年谈家桢生命科学创新奖
孙强 研究员
中国科学院上海生命科学研究院(神经科学研究所)

      孙强博士在非人灵长类模式动物构建中取得多项原创性突破：建立了基于精巢异种移植的繁殖加速技术，构建出世界首例自闭症转基因猴模型，在国际上首次获得体细胞克隆猴，攻克了非人灵长类体细胞克隆生物学世界性难题。

教育经历：

1992.9-1996.7 内蒙古民族大学 学士

1996.9-1999.7 扬州大学兽医学院 硕士

2002.9-2005.7 上海医药工业研究院 博士(在职)
工作经历：

1999.8-2005.7 扬州大学兽医学院 讲师

2005.9-2009.5 华东师范大学 副研究员

2009.6-2018.1 中国科学院神经科学研究所 正高级工程师

2018.2-至今 中国科学院神经科学研究所 研究员

主要贡献

　　孙强博士自毕业以来一直从事猴辅助生殖、转基因技术开发及模型动物构建等相关研究工作，并致力于非人灵长类基因修饰动物模型的推广应用。在早期的研究工作中掌握了猴辅助生殖技术，并成功构建了中国首批试管食蟹猴(PNAS，2008)。2009年6月入职中科院神经科学研究所后，开始搭建非人灵长类研究平台，取得了多项国际领先的研究成果。(1)在国际上首次利用核移植技术得到体细胞克隆猴，为基于体细胞克隆技术的基因编辑猴模型构建奠定了基础(Cell，2018);(2)建立了基于慢病毒转染的转基因猴构建技术，获得了具有类似人自闭症表型的MeCP2转基因食蟹猴模型(Nature，2016);(3)建立了基于精巢异种移植的猴繁殖加速技术，将雄性食蟹猴的性成熟时间由4年以上缩短到2年(Cell Research，2016);(4)建立了基于分子剪刀的基因敲除和敲入猴模型构建技术，成功得到了MeCP2、FMR1，Prrt2等多种基因敲除猴和Actb-Cherry基因敲入猴(Cell Research，2017 & 2018)。

　　(1) 首次获得体细胞核移植克隆猴

　　体细胞克隆又称体细胞核移植，是指通过显微操作技术将体细胞的细胞核导入到去核的卵母细胞中，得到一个含有体细胞基因组的重构胚胎，重构胚胎经激活后启动发育进程，再将其移植到代孕受体完成生长发育到个体出生的过程。在核移植前，对体细胞进行基因编辑操作可得到含有目的基因修饰的细胞。将基因修饰后的体细胞作为供体核进行克隆就可得到一批遗传背景一致的基因修饰克隆动物。体细胞克隆技术的建立对于开展非人灵长类基因编辑动物模型研究至关重要。首先，在体细胞上可实现复杂的遗传操作;其次，通过严格筛选可去除脱靶;最后，可在一个孕周期(160天)内获得多只遗传背景一致且无嵌合的克隆猴，因此完美的解决了现有基因编辑猴模型构建中存在的所有问题。

　　自1997年，首个体细胞克隆哺乳动物多利羊出生以来，利用该技术已经得到了包括马、牛、羊、猪等大型家畜，也得到了包括小鼠、大鼠、兔、猫和狗等多种实验动物。非人灵长类体细胞克隆研究始于2002年，其后尽管国内外多家科研机构不断尝试，但一直没有成功。这其中美国Oregon国家灵长类研究中心的Mitalipov教授团队曾先后用了15000多枚猴卵母细胞进行体细胞克隆猴实验，但最好的结果也只是得到了一个怀孕到81天的流产组织。如此巨大的挫败甚至令科学界怀疑现有方法无法实现非人灵长类的体细胞克隆。

　　孙强博士带领团队从2012年开始着手体细胞克隆猴的研究工作。首先在前人工作基础上对猴体细胞核移植技术进行了优化，缩短了核移植的操作时间，减小了对卵母细胞和体细胞的伤害，从而建立了熟练快速精确的猴体细胞核移植技术。为了提升克隆胚胎的体外发育效率和优质囊胚率，孙强博士不断尝试和摸索各种提升克隆胚胎重编程效率的条件，并最终发现通过联合使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和H3K9me3去甲基化酶Kdm4d可显著提高克隆胚胎的发育率。在此基础上，以来自流产猴成纤维细胞为供体细胞核进行核移植操作和胚胎移植后，成功得到2只健康存活个体。经微卫星DNA序列分析证明，这2只出生个体的核基因与供体细胞完全一致，证明已成功得到体细胞克隆猴。该工作2018年2月8日在 《Cell》杂志以封面文章的形式发表。该工作首次实现了利用体细胞核移植技术得到健康的克隆猴，为非人灵长类实验动物的基因编辑和模型构建提供了重要的技术支撑，被《Cell》杂志主编Emilie Marcus称赞为“生物技术领域近20年来的里程碑事件”。《Cell》杂志同期刊登了密歇根州立大学Jose Cibelli教授和剑桥大学2012年诺贝尔生理或医学奖得主John Gurdon教授合写的评论，以“新的里程碑”来评价该项工作。这项突破性成果也得到了科技界人士及国内外媒体的广泛关注和报道。

　　(2) 构建世界首例Mecp2转基因食蟹猴自闭症模型

　　自闭症是一种复杂的精神疾病，人类自闭症病患的复杂精神疾病症状往往很难在大小鼠等模式生物中得到准确体现。理想的动物模型对病理研究及药物开发与转化医学研究均有重要意义，因此是否可以用进化上接近人类的非人灵长类来构建精神疾病动物模型就成为国际神经科学界广泛关注的科学问题。孙强博士领导的团队与中科院神经所“神经可塑性分子基础研究组”仇子龙团队及其他课题组合作，自2010年开展了自闭症的非人灵长类动物模型构建工作。孙强博士团队通过慢病毒转染法高效地将人类自闭症基因 MECP2导入到食蟹猴卵母细胞，经进一步辅助生殖技术获得了MECP2转基因食蟹猴(F0)。研究团队通过行为分析发现，F0代转基因猴表现出类似人类自闭症病人的重复运动模式、焦虑水平上升、刻板行为与社交障碍等行为表型。通过精巢异种移植提前得到了F0的精子，并利用辅助生殖技术成功得到了携带人类 MECP2 基因的F1代转基因猴，表型分析结果表明，F0代的社交行为缺陷遗传给了F1代，证明MECP2基因在大脑中的过表达可直接导致非人灵长类产生类自闭症表型，并得到了稳定遗传的自闭症非人灵长类动物模型。这是首次报道获得表型可以稳定遗传的自闭症转基因猴模型。

　　此工作于 2016 年 1 月 26 日在《Nature》杂志在线发表，Nature杂志对此研究发表新闻评论文章称“此工作提供了前所未有的自闭症动物模型，将自闭症的研究向前推进了一大步”。该工作也入选科技部2016年度“中国科学十大进展”、中国科协2016年度“中国生命科学十大进展”。

　　(3) 建立基于精巢异种移植的繁殖加速技术

　　非人灵长类实验动物食蟹猴和恒河猴都有较长的性成熟时间，文献报道，雄性食蟹猴和恒河猴完成性成熟需要4-6年时间。孙强博士团队通过对雄性食蟹猴进行电刺激采精，射出物镜检的结果证明，在50月龄前的食蟹猴中无法采集到精子。说明食蟹猴的性成熟时间至少在4年以上，如此长的性成熟时间是非人灵长类模型得以广泛应用的一大障碍。为了解决这个难题，孙强博士团队开发了精巢异种移植加速获得食蟹猴活力精子的方法，通过将一只14月龄大的雄性食蟹猴的一侧睾丸取出，切成1mm见方的组织块后移植到去势裸小鼠的背部皮下，约经过11个月的生长后，成功得到了食蟹猴精子。进一步将这些精子注射到食蟹猴卵母细胞得到受精卵，再经胚胎移植成功，获得了健康的食蟹猴个体。团队同时利用该法对 F0代自闭症转基因公猴进行了睾丸组织移植，也顺利地获得了成熟精子，经辅助生殖成功得到了5只自闭症转基因食蟹猴的F1代，此项工作极大地加速了MeCP2转基因猴的传代进程，为证明自闭症转基因在世代间的传递提供了最为直接和关键的证据。这也是世界首个精神疾病可传代的非人灵长类动物模型，为深入探索自闭症的神经机理与可能的治疗干预方法提供了重要动物模型与研究平台。因此，该技术可将实验猴的传代时间缩短至2年，这将极大地促进非人灵长类动物模型构建和应用。

　　(4) 利用新型基因编辑技术构建基因编辑猴

　　为了探索和优化新型基因编辑的方法(TALEN和CRISPR/Cas9)在非人灵长类模型动物构建上的应用。孙强博士领导团队与中科院神经所“神经可塑性分子基础研究组”仇子龙团队合作，利用TALEN技术成功获得了MECP2 基因敲除的雄性食蟹猴。携带 MECP2 基因突变的男性人类胎儿通常无法存活，说明位于X染色体上MeCP2基因是致死基因，因此这只 MECP2 基因敲除雄性食蟹猴出生后立即死亡。团队在这只食蟹猴脑组织中检测发现 MECP2 基因被有效敲除，并引起 MeCP2 蛋白显著下降。此工作于 2014 年 6 月以封面文章发表在神经科学专业期刊《Neuroscience Bulletin》上，这是国际上较早报道利用基因编辑技术获得猴模型的工作之一。随着更为高效方便的CRISPR-Cas9技术的出现，团队与中科院神经所“疾病神经生物学研究组”熊志奇团队合作，建立了运动障碍相关基因Prrt2基因敲除食蟹猴模型。在模型构建中，为解决首建猴为嵌合体，且突变嵌合细胞比例低的问题，团队通过同时使用3条sgRNA对Prrt2基因进行编辑，成功获得两只Prrt2基因全突变的首建个体。利用该方法与中科院神经所“灵长类疾病模型研究组”杨辉团队在小鼠上的工作2017年发表在《Cell Research》上。同时，与杨辉团队合作，利用同源臂介导的末端接合技术在高效CRISPR-Cas9切割诱导下，实现了外源基因在食蟹猴特定基因上的定点插入。为了节约珍贵的猴胚胎资源，团队先期在食蟹猴的胚胎水平上实现了高效的靶向基因整合。之后通过进一步优化受精卵注入条件、质粒浓度和注射剂量，在提高敲入效率的同时保持正常的胚胎发育，进而获得基因敲入食蟹猴。最后成功在Actb (β-actin) 位点插入p2A-mCherry，并实现mCherry在Actb启动子的控制下的表达。该工作2018年1月与上海科技大学黄行许团队、昆明理工大学季维智团队和南京医科大学郭雪江团队类似的工作同时在《Cell Research》杂志上在线发表。这是国际上首批基因敲入猴模型工作报道，为在非人灵长类上实现复杂遗传操作和各种工具猴模型构建奠定了前期基础。